豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測試劑盒說明書

(HerdCheck* PRRS X3)

名稱和用途

HerdCheck* PRRS X3 抗體檢測試劑盒是用于檢測豬血清和血漿中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

概述

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種動(dòng)脈炎病毒，在80 年代后期在歐洲和美國發(fā)現(xiàn)，兩種毒株具有不同的抗原性1。該病毒引起繁殖問題（ 產(chǎn)弱仔，死胎， 母豬死亡）、呼吸系統(tǒng)疾病（肺炎，呼吸困難，行動(dòng)遲緩，死亡）和輕度神經(jīng)癥狀1。豬繁殖與呼吸綜合征引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被認(rèn)為是影響?zhàn)B豬業(yè)zui重要的疾病之一?？梢酝ㄟ^便捷的檢測血清或血漿中的抗體評估豬只是否感染PRRSV（無論是自然感染或人工免疫疫苗）。需要注意的是這種檢測抗體的免疫學(xué)方法需要對不同的PRRS 毒株的檢測都很敏感。

此試劑盒僅供體外檢測使用。

原理

HerdCheck* PRRS X3 抗體檢測試劑盒是用于檢測豬血清和血漿中PRRSV IgG 抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。將重組的PRRSV抗原包被在微孔滴定板上，被測樣品在包被孔中孵育時(shí)，針對PRRSV的特異性抗體與包被的抗原形成抗原抗體復(fù)合物，洗去包被孔中沒有結(jié)合的成分后，加入辣根過氧化物酶（HRPO）標(biāo)記的抗豬抗體，它與孔中的豬抗體結(jié)合，在試驗(yàn)的zui后步驟，洗去沒有結(jié)合的酶標(biāo)抗體，再加入酶底物和顯色劑TMB，顏色反應(yīng)的深淺由樣品中存在的抗PRRSV 特異性抗體的量決定。

試劑

所有試劑于2-8℃保存。

1. 重組PRRS 抗原包被板 5 塊

2. PRRSV 陽性對照 4 ml

3. 陰性對照 4 ml

4. HRPO 標(biāo)記抗豬IgG 抗體 60 ml

5. 樣品稀釋液 120 ml

A. 10 倍濃縮洗滌液 235 ml

B. TMB 底物液 60 ml

C. 終止液 60 ml

自備器材

適合 5-1000 μl 的微量移液器或連續(xù)移液器

一次性移液器吸頭

量筒，500 ml，配制洗滌液用

96 孔板酶標(biāo)儀

蒸餾水或去離子水

滴加和吸去洗滌液的設(shè)備

吸液用的真空和控制裝置

樣品稀釋的管子

使用注意事項(xiàng)

處理所有的生物材料，可能為潛在的傳染源。

不要用口移液。

使用樣品或試劑盒的場所不要吸煙，喝水和吃東西。

TMB 底物和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，避免底物與皮膚和眼睛接觸。

TMB 不要暴露于強(qiáng)光或任何氧化劑。取用TMB 顯色液要用潔凈的玻璃或塑料容器。

所有的試劑應(yīng)在2-8℃儲(chǔ)存。使用前拿到室溫（18-25℃），使用后放回2-8℃儲(chǔ)存。

所有的廢棄液應(yīng)在丟棄前合理處理，以免污染。

注意防止試劑盒內(nèi)的試劑污染。

不要使用過期的試劑，不同批次的試劑盒成分不要混用。

嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)和洗滌等全部過程必須。

每次檢測時(shí)都要設(shè)立陰陽性對照。

在檢測過程中，僅使用去離子水或蒸餾水稀釋和準(zhǔn)備試劑。

未用完的微孔板/條應(yīng)用塑料袋密封并儲(chǔ)存于2-8℃。

僅供獸醫(yī)使用。

試劑的準(zhǔn)備

用樣品稀釋液40 倍稀釋被測樣品（例如：5 μl 樣品加195 μl 樣品稀釋液）。

注意：不要稀釋陽性和陰性對照。

取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每個(gè)樣品在添加到PRRSV 包被板前應(yīng)混勻。

洗滌液的準(zhǔn)備

濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（18-25℃），并搖動(dòng)使沉淀鹽溶解。使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水10 倍稀釋（例如：每塊反應(yīng)板需要30 ml 濃縮洗滌液加入270ml 蒸餾水或去離子水中）。

操作步驟

使用前所有試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫（18-25℃）。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混合。每個(gè)樣品使用一個(gè)獨(dú)立的吸頭。

1. 取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。

2. 在包被孔內(nèi)加入100μl 沒有稀釋的陰性對照，每次檢測加兩孔。

3. 在包被孔內(nèi)加入100μl 沒有稀釋的陽性對照，每次檢測加兩孔。

4. 在相應(yīng)的孔中加入100μl 已稀釋好的樣本。

5. 18-25℃孵育30±2 分鐘。

6. 吸取各孔的液體棄入廢液筒。

7. 用大約300 μl 洗滌液洗滌板孔，共洗滌3-5 次。每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體。注意：應(yīng)避免包被孔干燥。在zui后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。

8. 每孔加入100 μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬IgG 抗體。

9. 18-25℃孵育30±2 分鐘。

10. 重復(fù)步驟6 和7。

11. 每孔加入100μl TMB 底物液。

12. 18-25℃孵育15±1 分鐘。

13. 每孔加入100μl 終止液，終止反應(yīng)。

14. 測量并且記錄樣本和對照的吸光值A(650)。

15．計(jì)算結(jié)果。

結(jié)果

符合下列條件，試驗(yàn)方能有效：

陽性對照的平均值減去陰性對照的平均值必須大于或等于0.150；此外，陰性對照的平均值（NCx）必須小于或等于0.150。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，應(yīng)按照操作說明書重做一次試驗(yàn)。PRRS 抗體的陽性/陰性通過計(jì)算樣品與陽性對照（S/P）的比值進(jìn)行判定。具體計(jì)算方法見樣品結(jié)果計(jì)算部分。

結(jié)果計(jì)算

1．陰性對照平均值的計(jì)算（NCx）：

NCx=(NC1 A650+ NC2 A650) /2例如：（0.064+0.08）/2=0.072

2．陽性對照平均值的計(jì)算（PCx）：

PCx=(PC1 A650+ PC2 A650) /2 例如：（0.560+0.596）/2=0.578

3．樣本/陽性對照比率的計(jì)算（S/P）:

S/P=(樣本A(650)－NCx) /(PCx－NCx)

例如：如果樣品的A（650）=0.750， S/P=（0.750-0.072）/(0.578-0.072)=1.34

結(jié)果闡述

PRRS 抗體的有無（陽性/陰性）通過計(jì)算每個(gè)樣品的S/P 值判定。

1. 如果S/P 值低于0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS 抗體陰性。

2. 如果S/P 值大于或等于0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS 抗體陽性。